细胞冻存与复苏-무석내사생명과학기술주식유한회사

一、如何处理收到的细胞

1.新买的或惠赠的细胞如何处理？

不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是否破裂；培养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。

2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？

常见原因可能有：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于–80℃太久。

二、复苏冻存的细胞

1.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

2.冷冻管应如何解冻？

将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

3.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？

现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO出去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

三、细胞培养用液

1.如何正确选择培养基种类？

培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。

天然细胞培养基：是人们早期采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富含氨基酸。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，血清的来源有胎牛血清、小牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和小牛血清。

合成细胞培养基：是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7 种，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。

无血清细胞培养基：是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成成分不含有任何动物组分。按照其组分分类，还可以分为无动物组分无血清细胞培养基和化学限定无血清细胞培养基，前者组分中可能含有某些植物来源成分，而后者完全由化学成分明确的组分组成。

其中，无动物组分无血清细胞培养基是目前在生物制药行业中应用最广泛的，它提高了细胞培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦。目前，已有多种无血清培养基上市，如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基和NS0 细胞无血清培养基等。

2.什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

3.细胞培养基的配制和储存应该注意什么？

细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃培养箱内放置24~48h，已检测培养液是否有污染，然后方可用于实验。配置培养基所需的血清要合格并且保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较容易。每次配液量以使用两周左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损失需要补充，二是量大易造成污染。

4. 为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏暗红色？

培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂（通常为 phenol red）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。

5.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

6.血清灭活是否必须？

这个问题现在有争议。有人主张价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟的热处理会对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面影响。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，尤其是在昆虫细胞和胚胎干细胞培养中。

7.培养基中是否添加抗生素？

除特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

8.何时更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

四、细胞传代

1.细胞传代的方法都有哪些？

根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

2.原代培养的首次传代应注意的问题？

细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代；原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要注意观察及时处理，并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间而分离和纯化所需要的细胞；吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增值；随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。

3.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？应如何处理？

EDTA作用较胰蛋白酶缓和，主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。

4.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为800~1000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

5.细胞的接种密度为何？

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

6.细胞交叉污染的可能原因？

多种细胞系进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。

五、细胞冻存

1.冷冻培养基为什么要加DMSO？

因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将造成细胞损伤，还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高包膜对水的通透性。

2.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？

冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

3.欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x10^6 cells/ml vial 为宜。

4.冷冻保存细胞的方法？

冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。

冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下，再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

5.细胞冻存太多会不会浪费？

每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用应冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变。

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