间充质干细胞属于成体干细胞，可在体外通过不同的方法干预下下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织，因其来源广泛，分离无创伤，较低的免疫原性、生长周期短等特点，是组织工程种子细胞的重要来源。干细胞的诱导分化一方面是干细胞鉴定的主要方法，另一方面也是干细胞功能学研究的主要途径。采用体外条件培养基诱导培养下，人间充质干细胞应能够分化为成脂肪、骨、软骨细胞。成骨分化经茜素红染色法鉴定。

实验前准备：

      试剂：PBS，成骨诱导分化培养基，茜素红

      耗材：NEST细胞培养皿，NEST普通吸头，NEST微量离心管

      设备：CO2培养箱，显微镜

一、接种骨髓间充质干细胞：

取对数生长期的细胞，按照2×105cells/cm2的细胞密度接种至包被后的细胞培养皿中，将接种好的细胞培养皿放到37℃，5% CO2细胞培养箱培养，定期观察细胞增殖状态，当细胞融合度达60-70%时，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

二、细胞分化诱导：

每2-3天进行换液（定期观察是否有污染），再放入37℃，5% CO2细胞培养箱中培养约2-3周，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况，决定终止细胞诱导的时间，进行下一步染色鉴定。

三、细胞固定：

用吸头（确保吸取充分）吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液细胞培养皿底面，室温固30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。

四、茜素红染色：

加入适量茜素红染液染3-5min，吸去茜素红染液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。

五、诱导评估：

显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

图c 间充质干细胞成骨诱导分化,茜素红染色显示钙结节..