一、实验室常用核酸的浓度与纯度检测
核酸浓度与纯度检测最简单常用的仪器是微量紫外分光光度计,代表为NanoDrop。NanoDrop分光光度计利用分子的紫外吸收特性来测定样品浓度。核酸吸收峰为260nm,蛋白样品吸收峰为280nm。此外,很多提取过程中残留的污染物通常在280nm和230nm处有吸收峰。[ NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN]样品浓度与吸光度成正比关系(Beer-Lambert Law),因此通过测定吸收峰就可以得出核酸样品的浓度。
核酸样品的纯度可以由A260/A280、A260/A230两个比值来反应。纯度较高DNA的A260/A280应在1.8左右,RNA在2.0左右。若DNA样品的A260/A280数值偏向2.0,则表明存在RNA污染,如有需要应使用RNA酶处理样品并纯化,反之亦然。A260/A230数值可以反应样品中有机物污染水平,一般大于2.0则较好,若偏低则表示产物中含胍或乙醇等有机物的污染(如表1所示)。
比值 | 测定样品 | “纯”样品的比值范围 | 比值异常的原因 |
A260/A280 | 核酸 | DNA: ~1.8 RNA: ~2.0 | 造成低比值的污染物: -蛋白质 -核酸提取步骤中的残余苯酚和其他试剂 |
A260/A230 | 核酸 | DNA/RNA: ~2.0-2.2 | 造成低比值的污染物: -蛋白质 -碳水化合物 -提取中的残余苯酚 -残余胍(常见于提取柱类方法) -用作辅助沉淀剂的糖原 造成高比值的原因: -空白对照有误 |
A260/A280 | 蛋白 | ~0.6 | 造成高比值的污染物: -核酸 |