核酸提取-무석내사생명과학기술주식유한회사

核酸提取是指将核酸（DNA和RNA）从细胞中提取出来的过程，总的来说包括细胞裂解、核酸纯化及后续核酸浓度、纯度测定的步骤。根据原始样品的种类和核酸产物后续的各种应用目的，细胞裂解和核酸纯化步骤有不同的处理方法和要求。

一、实验室中的DNA提取：

案例一：小鼠基因型判定实验的模板DNA提取

初始样品为小鼠尾切段。基因型判定实验对DNA模板的浓度、纯度要求不高，消化提取过程相对简单。

实验步骤：

1.将1cm尾巴切段置于1.5mL微量离心管中，加入适量裂解液（Lysis buffer）和蛋白酶（Proteinase K）于55~65℃水浴过夜消化。

2.充分消化后的尾巴样品加入沉淀液（Precipitation buffer）后用旋涡混匀器来使杂质蛋白充分沉淀，杂质沉淀后通过离心操作（如4℃，4000Xg，5min），取出溶有目标DNA的上清液，丢弃杂质沉淀。

3.上清液中加入100%异丙醇，小心颠倒离心管30~40次，便可以将产物DNA沉降。离心操作（4℃，10000Xg或12000rpm，10min）去除上清。

4.用75%乙醇洗涤两次DNA产物，待乙醇充分挥发后，用水或TE缓冲液（Tris-EDTA buffer）收获DNA模板产物。

进行后续的PCR扩增实验前，可以使用Nanodrop仪器来进行DNA浓度和纯度的测定来提高PCR反应的成功率。在PCR扩增实验不顺利的情况下，也可以进一步对DNA产品的完整度进行检测，具体方法可以参考核酸检测和核酸扩增的有关内容。

案例二：用于重组的质粒DNA提取

用于重组的质粒对DNA产物的浓度、纯度和完整度都要求较高，否则无法成功完成质粒酶切和酶连的步骤。

实验步骤：

1.从含有过夜培养大肠杆菌的试管中取出适量菌液置于微量离心管中，低速离心（4000Xg， 5min）处理后收获大肠杆菌，除去培养液。

2.使用质粒提取试剂盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大肠杆菌质粒。原理菌体裂解后，加入中和液（Neutralization buffer）过微型柱，使DNA特异结合于柱上，而其他杂质会过柱洗脱。最后用洗脱液(Elute buffer)洗下DNA即可得到质粒DNA产物。

3.经试剂盒提取后的质粒DNA有时需要经电泳切胶回收的操作将目标质粒DNA与其他DNA分离。切下的胶消化后经DNA纯化试剂盒纯化即可得到纯度较高的目标质粒DNA。具体的内容可以参考核酸检测的有关内容。

二、实验室中的RNA提取

[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance – Genetic Education]：

RNA提取过程与DNA类似，也是通过裂解细胞后通过有机溶剂（苯酚、氯仿、异戊醇）沉降杂质的方法来分离RNA。但RNA的稳定性比DNA低很多，因此对RNA提取对温度和污染清除的要求更高。实研操作一般从以下几个角度来提升成功率：降低RNA水解酶活性、提升RNA稳定性、使RNA与DNA和蛋白分离、仅沉降RNA、有效去除DNA。

案例一：总RNA提取

实验步骤与DNA提取类似，但有机溶剂的使用会有所不同。在首次离心后，混合物会分为三层，RNA溶于上层无色水相，而DNA和蛋白会处于中间层，组织残渣等杂质处于底层酚-氯仿相中²。

实验步骤：

1.向提取样品中加入裂解液（如Trizol），裂解细胞与组织，室温静置5-8分钟。

2.加入氯仿，充分混匀后离心（4℃，12000rpm，10min），取出上清液。

3.向上清液中加入异丙醇沉降RNA，并离心（4℃，12000rpm，10min）弃去上清。

4.用75%乙醇洗涤产物两次，待乙醇挥发后加入RNase-free水溶解产物。

实验中用到的耐思耗材和仪器：

枪头、微量离心管、（15、50mL）离心管、迷你旋涡分离器（105003）。

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